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新型冠状病毒患者的淋巴细胞亚群和细胞因子检测生物安全性建议

(一)微生物学

2019 新型冠状病毒是人类分离的第七类冠状病毒。该病毒属于β属,有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径 60-140nm。其基因特征与 SARS-CoV 和 MERS-CoV 有明显区别。目前研究显示与蝙蝠 SARS 样冠状病毒(Bat-SL-CoV ZC45)同源性达 85%以上。目前已经获得该病毒的全基因组序列、电镜照片,体外分离培养已经成功。

对冠状病毒理化特性的认识多来自对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的研究。病毒对紫外线和热敏感,56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。氯己定不能有效灭活病毒。

(二)流行病学及安全原则

1、呼吸道标本(鼻咽拭子、咳痰、抽吸痰、BALF、PSB、组织等)含有病毒,有传染性。部分患者,尤其是危重型患者,会有病毒血症。病毒血症时的血液标本,有传染性。部分患者有腹泻症状,粪便标本已证实有病毒分离,按有传染性处理。胸腔积液少见,尚未证实胸腔积液标本的传染性,建议按有传染性处理。

2、尚无病毒载量信息的标本:尿液、胸腔积液之外的其他正常无菌体液(脑脊液、心包积液、腹腔积液、后穹隆穿刺液、关节液)、腹膜透出液、精液、女性生殖道分泌物等,建议目前按有传染性处理。 

3、传播途径:目前明确的途径包括呼吸道飞沫传播、气溶胶传播、接触传播。粪便已有病毒分离,不除外其他传播途径。

防止气溶胶传播感染:在采血过程中、使用注射器、离心、拔帽、加样、全自动仪器设备工作等过程中均可产生气溶胶,由于许多患者及其标本含有病原微生物,在产生大量气溶胶并扩散到空气中时,可污染实验室的空气;这些包含病原微生物的气溶胶粒子可能会被操作者吸入、或粘附在裸露的皮肤衣物上、或粘附于随处乱放的手机等物品上、或飞入水杯中等等;因此,这种污染空气的现象还是普遍存在的。本实验过程中不可避免的产生气溶胶,须注意气溶胶的安全防护。产生气溶胶的操作包括:流式管加入样本和试剂后以及加入溶血素后的涡旋震荡及离心都可产生气溶胶。防止气溶胶污染,则个人必须按三级生物安全防护。

4、未经培养的感染性材料操作:如不能可靠灭活,进行病毒抗原检测、血清学检测、生化分析等操作时应在生物安全二级实验室开展,尽可能在生物安全柜中进行,个人采用三级生物安全防护。 

5、确诊患者标本,建议三级生物安全防护。一般患者,发热状态和疑似患者标本,可以二级生物安全防护,或在此基础上适度加强。                    

(三)待测样品的生物安全预处理:

产品试剂盒中不含杀灭病毒的组分。相关指南中指出病人的痰液、咽拭子、下呼吸道标本(如气管分泌物、气管吸取物、肺泡灌洗液)、血清,血浆,全血,粪便等都是含有病毒的感染源。固在未有临床明确诊断前,感染者和非感染者难以区分,应将所有样本视为具有感染性。

《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第四版)》中指出:病毒在4℃合适维持液中为中等稳定,-60℃可保存数年,新冠状病毒对热敏感,保持56℃-30分钟,紫外线、乙醚、来苏水、75%乙醇、含氯消毒剂、甲醛、0.1%过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒,但氯已定不能有效灭活病毒。冠状病毒不耐酸、不耐碱,病毒复制的最适宜pH为7.2。  

因白细胞分化抗原和细胞因子属于生物蛋白质分子,上述推荐杀灭病毒的处理方法会破坏其生物活性和结构,干扰试剂检测结果。且紫外线只适用于杀灭表面病毒,因此不能有效杀灭待测外周血样本中病毒。综合现有诊疗方案及相关指南中提到灭活病毒方法,都不适用于检测淋巴细胞亚群和细胞因子等血液标本预处理。目前尚无实验室已验证并可有效灭活流式检测血液血样本的冠状病毒的方法。

因此应在生物安全二级实验室开展,尽可能在生物安全柜中进行。操作过程须打开样本试管塞,可能产生气溶胶,或可能接触标本本身,个人按则按三级生物安全防护。

(四)检测中的生物安全性防护

因病毒可能的传播途径包括飞沫传播、粪口传播以及接触传播。在处理含病毒的血液本(包括未知高危样本)应在生物安全二级及以上实验室条件下进行。1、标本离心:操作者不能离开离心机。如果疑似意外,比如离心过程有异常声响,则停 止离心。改为三级生物安全防护后,停止离心 30min 以上,小心开盖,75%乙醇喷雾消毒后 进行处理。尽可能在生物安全柜中将离心管放入和取出转子。标本离心无意外,离心停止10min以上,开离心机盖喷雾消毒。按检测项目和工作分工,将标本送抵相应实验区操作台“未检标本处”。

2、检测样本制备过程:应在二级生物安全柜(按ABSL-2防护水平要求)中进行操作,遵守相关操作规程,使用有盖的流式检测管。操作过程中,操作者轻柔缓慢打开采血样本管盖和流式管盖,操作者须三级生物安全防护。尽可能地使用一次性器具,生物安全柜内75%酒精消毒和紫外线照射。

3、流式细胞仪检测:上机前轻柔缓慢打开流式管盖,和操作者面部保持距离,打开试管塞后,则消毒盖子后弃去,操作者须三级生物安全防护。

4、个人防护:参见《新型冠状病毒感染的肺炎防控中常见医用防护用品使用范围指引(试行)》(2020.1.26),如下:

1)防护用品:医用外科口罩(YY0469-2011)、医用防护口罩(GB19083-2010)、N95(美 国 NIOSH42CF R84-1995)(下文行文包括 KN95[GB2626-2019])、全面型呼吸防护器、防护 服、隔离衣、工作服、乳胶手套、医用防护帽、护目镜、防护面具或防护面屏、鞋套和防水高靴。

2)二级生物安全防护:医用防护口罩或 N95 口罩、乳胶手套、工作服外隔离衣、医用防护帽,加手卫生。酌情(比如有喷溅风险)可加护目镜。 

3)三级生物安全防护:医用防护口罩或  N95、单或双层乳胶手套(条件许可,可以不同颜色)、面屏、护目镜、工作服外防护服、单或双层医用防护帽,加手卫生。必要时双层口罩(外医用防护口罩,内 N95)。

4)佩戴注意事项:外科口罩佩戴时,双手沿鼻沿压紧贴合。所有口罩戴上后确认密封;摘下时不要触碰正面。防护服脱之前,全身喷雾消毒(比如有效氯浓度 500mg/L 消毒剂),按标准流程依次脱个人生物安全防护装备,污染面切勿接触内部衣物。

5)紫外:符合行业标准(紫外线杀菌灯 GB 19258-2012)。定期检测性能、完整记录、累积使用不超过规定时限。消毒时间不少于 30min。

6)消毒液:每天试验前后使用 500mg/L 有效氯的消毒液(84消毒液100 倍稀释)或 75%乙醇进行桌面、台面及地面消毒。消毒液新鲜配置,不超过24小时。

7)仪器消毒:移液器以及漩涡震荡仪器使用75%乙醇消毒,操作后流式细胞仪用75%乙醇冲洗30分钟。

8)环境:实验区符合二级或三级生物安全实验室规范。

(五)废弃物处理

    对检测完成后的疑似病人样本采用双层塑料袋密封;对实验过程中产生的废液和枪头等置于含0.5%~1%有效氯的含氯消毒液的废液缸。上述物品经压力蒸汽灭菌处理。详见《新型冠状病毒实验室生物安全指南》(第三版)。

(六)样本的运输

标本采集、运送、存储和检测暂按二类高致病性病原微生物管理,按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》及《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》(卫生部令第45号)的要求执行

(七)生物安全柜操作注意事项:

⑴风机运行至少5min后方可开始操作;

⑵柜内尽量少放物品,以免影响气流循环;

⑶避免干扰气流,不良行为包括手臂频繁出入,操作者身后人员频繁走动,阻挡空气格栅;

⑷在中后部操作,并不影响透过玻璃挡板观察;

⑸柜内不可进行文字工作;

⑹风机运行至少5 min后方可关机;

⑺工作完成后、每天下班前,使用适当消毒剂擦拭表面。

                                   

参考资料:

1.国家卫生健康委2020年1月28日发布《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检检测技术指南(第三版)》

2.中华医学会检验分会2020年1月30日发布《2019新型冠状病毒肺炎临床实验室检测的生物安全防护指南》

3. 《新型冠状病毒感染的肺炎防控中常见医用防护用品使用范围指引(试行)》(2020.1.26)

4. 《新型冠状病毒实验室生物安全指南》(第三版)

5. 《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第四版)》

 


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