γ干扰素释放分析T-SPOT.TB诊断结核感染临床应用

结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO估计, 全球有约20 亿人感染结核分枝杆菌,每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一, 结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上。结核病的临床表现多样, 可以累积全身各个系统, 尤其是肺外结核病变往往十分隐匿, 给临床诊断带来极大的困难。结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST)是长期以来用以快速诊断结核感染的唯一手段。然而TST 存在诸多缺陷: 在易受结核感染的免疫力低下人群中, 其敏感性反而大大降低; 结核菌素纯蛋白衍生物(purified prote in derivatives, PPD)是200多种蛋白的混合物, 其中很多是非结核分枝杆菌及卡介苗(Bacillus Calmette-Gurin, BCG)的共同抗原成分, 在普遍接种BCG 的地区造成非常高的“假阳性”率。此外, 皮试的操作和结果的解释存在主观依赖性, 降低了检查的准确性。T-SPOT.TB 是以特异性抗原为刺激源, 应用酶联免疫斑点技术(enzym e-linked mimunospot assay,ELISPOT)诊断结核感染的新方法。
结核分枝杆菌感染后机体的免疫应答根据结核感染的状态, 人群可以分为无结核感染、活动性结核、潜伏性结核和治愈。结核分枝杆菌是胞内寄生菌, 侵入机体后, 首先引起固有免疫反应, 被巨噬细胞吞噬。在大多数感染者中, 单纯的固有免疫并不足以抑制结核分枝杆菌的生长增殖。被感染的巨噬细胞凋亡后, 释放出大量特异性抗原,可被树突状细胞加工呈递给特异性的CD4、CD8和CDT 细胞, 以及CD1限制性T 细胞, 继而引发获得性免疫。CD4 T 细胞在结核免疫防御机制中发挥主要作用, 特异性的CD4 T 细胞与抗原肽-主要组织相容性复合体2类分子复合物结合后被激活, 分泌C干扰素, 从而激活巨噬细胞发挥抗结核活性。特异性CD8 T 细胞产生效应因子肿瘤坏死因子A和干扰素C并释放颗粒酶和穿孔素溶解感染细胞, 同时启动Fas途径发挥其溶细胞作用。γ干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子。在大多数免疫力正常的感染者中, 获得性免疫能够控制却不足以清除结核感染, 吞噬了结核分枝杆菌的巨噬细胞被纤维包裹形成肉芽肿而使感染局限, 这时机体呈现一种无症状的潜伏性感染状态, 而结核特异性的中央型记忆细胞(CCR7+CD27+)和效应型记忆细胞(CCR7-CD27-)在机体中长期存在。潜伏性结核感染者一生中有10% 的可能发生结核病, 约5% 在两年内复发表现为活动性结核,另有5% 将在此后的时间内复发。由于潜伏感染者的体内长时间存留活菌, 当出现各种原因导致机体的免疫力低下时,结核复发的风险显著增加,如结核合并人免疫缺陷病毒(human mimunodeficiency virus,HIV)感染时, 发展为活动性结核的风险将增加至每年10%。
T-SPOT.TB的原理及结果判断
T-SPOT.TB是以ELISPOT 技术检测结核感染的新方法, ELISPOT 技术是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术, 是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一, 可以检测出1 /100 000~1 /50 000外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中经某种抗原刺激后释放某种细胞因子的细胞, 经过酶联显色后, 通过ELISPOT分析系统(ELISPOT Reader)对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞, 从而计算出抗原特异性细胞的频率。T-SPOT.TB 的产生得益于基因分子生物学和免疫学的进展。1999年, Behr等应用基因芯片技术将结核分枝杆菌标准株H37Rv和BCG的全基因组进行比较, 结果显示129个只特定存在于结核分枝杆菌而在BCG中缺失的开放读码框, 这些在BCG中缺失的部分被划分为16个区域, 命名为RD1 ~RD16, 其

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